CRISPR-Cas9是近年來興起的基因組編輯工具，已被應(yīng)用在水稻、玉米和擬南芥等二倍體植物中構(gòu)建靶向敲除突變體庫，但應(yīng)用到四倍體作物中還鮮有報道。異源四倍體甘藍(lán)型油菜（Brassica napus,AACC,2n=38）是我國第一大油料作物，利用CRISPR-Cas9對其復(fù)雜基因組進(jìn)行高通量靶向突變，將為具優(yōu)異性狀的新種質(zhì)的高通量創(chuàng)建、重要新基因的批量挖掘、乃至油菜分子設(shè)計育種奠定堅實基礎(chǔ)。
在本文中，作者首先設(shè)計了18414個sgRNA以用于靶向10480個與油菜生殖器官發(fā)育和種子形成等相關(guān)基因。將該混合的CRISPR-Cas9表達(dá)文庫遺傳轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜獲得1104個轉(zhuǎn)基因再生株系。測序分析結(jié)果表明，所檢測的178個靶基因里有93個發(fā)生了靶點編輯，即評估的靶點編輯效率為52.2%。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)sgRNA同時靶向多個油菜基因同源拷貝時，Cas9蛋白傾向于切割所有的拷貝從而實現(xiàn)靶位點的編輯。同時，作者利用已檢測過靶點編輯情況的轉(zhuǎn)基因株系對多種重要表型進(jìn)行了反向遺傳學(xué)篩選，驗證了該突變體庫高通量篩選特征及部分基因的功能；并進(jìn)一步通過正向遺傳學(xué)篩選挖掘到系列控制種子含油量或脂肪酸組分等重要農(nóng)藝性狀的新基因，這些基因的編輯可明顯改變種子的含油量或脂肪酸組分。
該工作為甘藍(lán)型油菜基因功能的高通量研究提供了寶貴種質(zhì)資源，所發(fā)掘的系列調(diào)控含油量等重要農(nóng)藝性狀的新基因，為油菜重要農(nóng)藝性狀的分子改良提供了有價值的基因資源。同時，該研究也為其它多倍體植物開展高通量的靶向突變提供了一個有益的借鑒。
華中農(nóng)業(yè)大學(xué)張椿雨教授和華中科技大學(xué)栗茂騰教授為論文共同通訊作者，博士生何堅杰及張凱博士為共同第一作者，博士生閆書祥、碩士生唐蜜和周惟賢、尹永泰博士和陳康博士也參與了此項研究。本研究得到國家重點研發(fā)計劃“油菜和花生重要基因資源挖掘與利用”（2022YFD1200402）和國家自然科學(xué)基金面上項目(32272067和32072098)的資助。
審核人：張椿雨
論文鏈接：
https://genome.cshlp.org/content/early/2023/05/30/gr.277650.123.full.pdf+html
2023年6月10日
來源：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
